在細胞培養(yǎng)技術(shù)中，細胞計數(shù)是一項基本技能，對于規(guī)范培養(yǎng)條件和需要量化的實驗至關(guān)重要。本文介紹了用血細胞計數(shù)器計數(shù)細胞的經(jīng)典方法和一些需要注意的細節(jié)。

　　細胞懸液的制備:

　　對于貼壁細胞，我們需要用胰蛋白酶消化，使細胞從培養(yǎng)皿表面脫落。

　　根據(jù)需要，加入適當體積的培養(yǎng)基來中和和稀釋細胞，以獲得均質(zhì)的細胞懸液。要求盡量吹凈細胞，不要留下任何細胞團。

　　準備血細胞計數(shù)器:

　　用70%乙醇清潔蓋玻片和血細胞計數(shù)器。

　　將蓋玻片弄濕(用水或呼吸，使蓋玻片與血細胞計數(shù)器接觸更緊密，更容易粘在一起)，蓋在血細胞計數(shù)器上。

　　臺盼藍染色(可選):

　　如果有必要計算細胞活力，則有必要將細胞懸液與等體積的0.4%臺盼藍混合。

　　室溫孵育3-5分鐘，使臺盼藍進入死細胞，使死細胞呈藍色。

　　血細胞計數(shù)器加載:

　　用移液管將細胞懸液或細胞/臺盼藍混合溶液滴到血細胞計數(shù)器的計數(shù)池邊緣。此時，液滴會在虹吸作用下進入蓋玻片下的計數(shù)池。

　　同樣，細胞懸浮液也被添加到另一側(cè)的計數(shù)池中。

　　將計數(shù)板放置幾分鐘，使細胞散開，同時用吸水紙吸收多余的液體。

　　細胞計數(shù):

　　在100倍的顯微鏡下，移動計數(shù)板將視場對準計數(shù)板的中央大正方形，四周是一圈三條平行線，中間是密密麻麻的網(wǎng)格。中央的正方形區(qū)域幾乎可以填滿整個視野。

　　用手持計數(shù)器記錄計數(shù)池四個角和中央方格的細胞數(shù)(位置1-5，經(jīng)典電流-協(xié)議建議每個方格的細胞數(shù)不大于20-50)，重復記錄另一側(cè)計數(shù)池的細胞數(shù)，共計十個方格。計數(shù)方法是只計數(shù)被上下兩條線壓住的細胞，不計數(shù)被上下兩條線壓住的細胞(如下圖所示，總的原則是“數(shù)而不數(shù)，數(shù)左而不數(shù)右”，判斷標準是是否觸及三條邊線的中線)。如果有多個單元格未被吹成一組，則只能記錄為一個單元格。如果有很多腫塊，可能需要重新吹甚至消化，直到大部分細胞都是單細胞。