微生物檢測在理論研究和生產(chǎn)實踐中都具有重要意義。簡要介紹了二十多種常用的利用微生物重量、體積、大小、生理代謝產(chǎn)物等指標的檢測方法，并簡要介紹了這些方法的原理、適用范圍和優(yōu)缺點。

　　在合適的外界條件下，一個微生物細胞不斷地吸收營養(yǎng)，按照自己的代謝模式進行代謝。如果同化的速度超過異化的速度，原生質(zhì)的總量(重量、體積、大小)就會不斷增加，于是就有了個體的成長。如果這是一種平衡生長，即當每個細胞成分以適當?shù)谋壤L時，達到一定程度后就會繁殖，從而引起個體數(shù)量的增加。這時，原來的個體已經(jīng)發(fā)展成了群體。隨著一個群體中每個個體的進一步成長，引起這個群體的成長，可以用它的體積、重量、密度或濃度來衡量。微生物的生長不同于其他生物的生長，微生物的個體生長在科學研究上是困難的，通常沒有實際意義。微生物以數(shù)量取勝， 所以微生物的增長通常是指種群的擴大。微生物的生長繁殖是其與各種內(nèi)外環(huán)境因素相互作用的綜合反映。因此，生長和繁殖可以作為研究各種生理、生化和遺傳問題的重要指標。同時，微生物在生產(chǎn)實踐中的各種應用或病原性、霉變性微生物的防治都與其生長抑制密切相關(guān)。因此有必要介紹微生物生長的檢測方法。由于生長意味著原生質(zhì)含量的增加，所以測定方法都是以直接或間接為基礎(chǔ)，而繁殖的測定則應以計數(shù)為基礎(chǔ)。微生物的生長可以通過其重量、體積、密度、濃度來衡量，作為衡量的指標。

　　1.微生物測定法

　　1.1體積測量方法

　　又稱菌絲體濃度測量法，通過測量體積培養(yǎng)基中所含菌絲體的量來反映微生物的生長狀況。方法是:將一定量的培養(yǎng)液(如10 mL)放入帶刻度的離心管中，設(shè)定離心時間(如5 min)和轉(zhuǎn)速(如5000 rpm)，離心后倒出上清液。當測得上清液體積為V時，菌絲體濃度為(10-v)/10。菌絲體濃度的測定是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中微生物生長的重要監(jiān)控指標。這種方法廣泛、簡單、快速，但需要設(shè)定一致的處理條件，否則偏差會很大，因為離心沉淀中混有一些固體營養(yǎng)物，結(jié)果會有偏差。

　　干重法

　　它可以通過離心或過濾來確定。一般干重為濕重的10~20%。在離心法中，將待測體積的培養(yǎng)液倒入離心管中，以設(shè)定的離心時間和轉(zhuǎn)速離心，用清水離心洗滌1-5次，并干燥。干燥可在105℃或100℃的烘箱中進行，或通過紅外線，或通過80℃或40℃的真空干燥，然后稱重。如果用過濾法，絲狀真菌可以用濾紙過濾，細菌可以用醋酸纖維素膜等濾膜過濾。過濾后，用少量水洗滌，并在40℃真空干燥。叫干繁殖法很復雜。通常，當獲得的微生物產(chǎn)物為菌體時，常采用這種方法，如活性干酵母、ADY)、一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。

　　1.3濁度法

　　微生物的生長導致培養(yǎng)物濁度增加。紫外分光光度計用于測量該波長處的光吸收值，以判斷微生物的生長情況。一個帶側(cè)臂的新三角瓶可以用來定期跟蹤培養(yǎng)物中細菌的生長。將側(cè)臂插入光電比色計比色座的孔中，無需取菌液即可隨時測定其生長情況。這種方法主要用于監(jiān)控發(fā)酵工業(yè)中細菌的生長。如UN公司的紫外-可見分光光度計，通過用比色管在600 nm波長下測量吸光度值OD600，來監(jiān)測大腸桿菌的生長和誘導時間。

　　1.4菌絲體長度測量方法

　　對于絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養(yǎng)基中測量菌絲的生長長度，或者用一端開口、帶有刻度的細玻璃管，進入合適的培養(yǎng)基，躺下，在開口的一端接種微生物，一段時間后記錄菌絲的生長長度，從而測量絲狀微生物的生長情況。

　　2.微生物計數(shù)法

　　2.1血細胞計數(shù)平板法

　　血細胞計數(shù)板是一種具有結(jié)構(gòu)尺度和厚度的厚玻璃片。載玻片上有四個凹槽和兩個脊，中央有一個短的水平凹槽和兩個平臺。兩個脊的表面比兩個平臺的表面高0.1毫米。每個平臺上刻有不同規(guī)格的網(wǎng)格，中心0.1 mm2的面積上刻有400個小方塊。用油鏡觀察，統(tǒng)計一個大細胞中的微生物數(shù)量，就可以算出1毫升菌液中所含的細菌數(shù)量。這種方法簡單、直觀、快速，但只適用于對單細胞微生物或絲狀微生物產(chǎn)生的孢子進行計數(shù)，結(jié)果是包括死細胞在內(nèi)的細菌總數(shù)。

　　2.2染色計數(shù)法

　　為了彌補某些微生物在油鏡下不易觀察計數(shù)，血細胞計數(shù)平板法無法直接區(qū)分死細胞和活細胞的不足，人們發(fā)明了染色計數(shù)法。借助不同的染料，在顯微鏡下可以更方便地計數(shù)活菌。例如，可以用亞甲藍染色液來計數(shù)酵母活細胞的數(shù)量。染色后，活細胞無色，死細胞藍色。

　　2.3比例計數(shù)法

　　將顆粒濃度已知的液體(如霉菌孢子或紅細胞)與待測細胞濃度的菌液按比例均勻混合，通過在顯微鏡視野內(nèi)計數(shù)它們各自的數(shù)量，即可得到未知菌液的細胞濃度。這種計數(shù)方法比較廣泛。并且有必要制備具有已知顆粒濃度的懸浮液作為標準。

　　2.4液體稀釋法

　　未知細菌樣本被連續(xù)稀釋10倍。根據(jù)估計的數(shù)量，從三個合適的連續(xù)10倍稀釋物中取出5 mL樣品，并接種到1 mL至三組15個含有培養(yǎng)液的試管中。培養(yǎng)后，記錄每個稀釋度下生長的試管數(shù)，然后通過查MPN(最可能數(shù))得到細菌樣本中的細菌數(shù)，根據(jù)樣本的稀釋倍數(shù)計算活菌含量。這種方法常用于檢測食品中的微生物，如飲用水和牛奶的微生物限度檢查。

　　2.5平板菌落計數(shù)法

　　這是一種計數(shù)活細菌的常用方法。對待測菌液進行梯度稀釋，取一定體積稀釋后的菌液，在固化前與合適的固體培養(yǎng)基混合均勻，或?qū)⒕和坎荚诠袒蟮墓腆w培養(yǎng)基平板上。孵育后，原始細菌溶液的細菌計數(shù)可以通過將平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以細菌溶液的稀釋度來計算。直徑9 cm的平板上一般要出現(xiàn)50~500個菌落。但是方法比較麻煩，操作者需要熟練的技術(shù)。平板菌落計數(shù)法不僅可以得到菌液中的活菌數(shù)，而且可以一次分離培養(yǎng)菌液中的細菌，得到單克隆。

　　2.6試劑紙

　　在平板計數(shù)法的基礎(chǔ)上，開發(fā)了用于快速計數(shù)的小型商用產(chǎn)品。有小而厚的濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂上吸取合適的培養(yǎng)基，加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，無色)浸泡試驗菌液，然后在密封包裝袋中培養(yǎng)。短期培養(yǎng)后，可將濾紙上玫瑰色微菌落的密度與標準紙色板上的光譜進行比較，以估計樣品的細菌含量。試紙計數(shù)法快速準確，避免了平板計數(shù)法的人為操作誤差。

　　2.7薄膜過濾法

　　含菌樣品用專用濾膜過濾體積，橙黃染色，紫外顯微鏡下觀察細胞熒光。活細胞會發(fā)出橙色熒光，而死細胞會發(fā)出綠色熒光。

　　3.間接測定法

　　微生物的生長伴隨著一系列生理指標的變化，如pH值、含氮量、含糖量、產(chǎn)氣量等。與生長量平行的生理指標有很多，可以作為生長測量的相對值。因此，生理指標等間接參數(shù)可以用來衡量生物量。

　　3.1氮含量的測定

　　大多數(shù)細菌的含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%。根據(jù)含氮量×6.25，可以確定粗蛋白的含量。測定氮含量的方法有很多，如碘消化法、磷酸消化法和杜馬斯法測定N2氣體。杜馬斯測量N2氣體的方法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱，產(chǎn)生氮氣，收集在呼吸計中，用KOH吸收CO2后測量N2的量。

　　3.2碳含量的測定

　　將少量(0.2~2.0 mg干重)生物材料混入1 mL水或無機緩沖液中，用2 mL 2% 2% K2Cr2O7溶液在100℃加熱30分鐘，然后冷卻。加水稀釋至5 mL，在580 nm波長處讀取吸光度值，計算生長量。需要使用試劑作為空白對照，使用標準樣品作為標準曲線。

　　還原糖測定方法

　　還原糖通常指單糖或寡糖，可被微生物直接利用。還原糖的測定可以間接反映微生物的生長情況，常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中微生物生長的常規(guī)監(jiān)測。方法是:離心，取上清液，加入費林試劑，沸水浴煮沸3分鐘，取出加少許酸化，在接近終點時加入淀粉溶液，繼續(xù)加入Na2S2O3至終點，查表讀出還原糖含量。

　　3.4氨基氮的測定

　　離心，取上清液，加入甲基紅和指示劑，加入0.02 mol/L NaOH顯色至顏色剛好褪色，加入18%中性底物，反應數(shù)分鐘，加入0.02 mol/L NaOH使其變色，根據(jù)NaOH用量計算氨基氮含量。根據(jù)培養(yǎng)基中氨基氮的含量，可以間接反映微生物的生長狀況。

　　3.5其他生理物質(zhì)的測定

　　P、DNA、RNA、ATP、NAM(乙酰胞壁酸)的含量和其他指標，如產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、產(chǎn)CO2(使用標記作為底物)、耗氧量、粘度和產(chǎn)熱，可用于確定生長。還可以根據(jù)反應前后底物濃度、最終產(chǎn)氣量、微生物活性的變化來反映微生物的生長情況。比如在BMP-2的發(fā)酵生產(chǎn)中，可以隨時監(jiān)測溶解氧和pH值的變化來判斷細菌的生長情況。

　　4.商業(yè)快速微生物檢測方法

　　微生物檢測的發(fā)展方向是快速、準確、簡便和自動化。目前，許多生物制品公司利用傳統(tǒng)的微生物檢測原理，結(jié)合不同的檢測方法，設(shè)計出各種類型的微生物檢測儀器和設(shè)備，逐漸廣泛應用于醫(yī)學微生物檢測和科學研究中。例如:

　　4.1試劑盒、培養(yǎng)基和其他手段

　　抗干擾培養(yǎng)基與快速微生物數(shù)量檢測技術(shù)的結(jié)合，解決了傳統(tǒng)微生物檢測方法無法解決的問題，為建立完整的抗干擾微生物檢測系統(tǒng)奠定了堅實的基礎(chǔ)。如:抗干擾微生物培養(yǎng)基、新型生化鑒定管、微生物計數(shù)卡、環(huán)境質(zhì)量檢測試劑盒等。，可方便地用于多種測試。

　　4.2借助新儀器

　　BACTOMETER的全自動細菌總數(shù)和快速細菌檢測系統(tǒng)可在數(shù)小時內(nèi)獲得監(jiān)測結(jié)果，樣本的顏色和光學特性不影響讀數(shù)。它對酵母和霉菌的檢測也非常敏感。原理是通過阻抗技術(shù)將待測樣品和培養(yǎng)基置于反應試劑盒中，底部有一對不銹鋼電極，測量微生物生長引起的阻抗變化。例如，當微生物生長時，培養(yǎng)基中的大量營養(yǎng)物質(zhì)可以通過代謝轉(zhuǎn)化為活性小分子，這種微弱的變化可以用電阻抗法檢測，這樣就可以比傳統(tǒng)的平板法更快地監(jiān)測微生物的存在和數(shù)量。測定項目包括細菌總數(shù)、酵母菌、大腸桿菌、霉菌、乳酸菌、嗜熱菌、 革蘭氏陰性菌等。

　　微生物OD值是反映細菌生長狀態(tài)的指標，OD是光密度的縮寫，表示被檢測對象吸收的光密度。通常400~700 nm是微生物測定的范圍，所以需要用紫外分光光度計測量吸收波長。最常用的有:菌絲體505 nm，酵母560 nm，細菌600 nm。通過測定OD值繪制微生物生長曲線時，同一菌株的初始培養(yǎng)濃度可準備多個試管(根據(jù)檢測點的需要，如需檢測10個點，可準備10個試管)，然后從每個點取一個試管測OD值。

　　一般用于測量細胞密度的OD的波長范圍為580 nm-660 nm，如枯草芽孢桿菌的600 nm，已經(jīng)屬于可見光區(qū)(200 nm-400 nm為紫外光區(qū)，400 nm-800 nm為可見光區(qū))。如果空白是水做的，需要離心清洗；如果空白是用未接種的培養(yǎng)基制作的，則不需要清洗，但未接種的培養(yǎng)基應與接種同時培養(yǎng)，以達到相同的條件。之后注意OD值一般控制在0.1~0.4，這個區(qū)域的數(shù)值比較可靠。如果OD大于1.0，則應稀釋并再次測量。因為OD太大，分光光度計的靈敏度會明顯降低。

　　一般測量吸收值，整個實驗過程中保持細菌稀釋倍數(shù)一致就好，吸收值與稀釋倍數(shù)不成正比，可以保證整個實驗點的可比性。而且取值的時候要連續(xù)讀，重復三遍。

　　另外，為什么用分光光度計測量微生物的OD值時，波長要設(shè)置為600 nm？

　　這個波長其實只針對濁度，分光光度計在600 nm處對濁度比較敏感。測量吸收峰實際意義不大。例如，在LB搖瓶中過夜培養(yǎng)的大腸桿菌實際上在400納米以上有吸收，但那很可能是培養(yǎng)液的吸收峰。