微生物檢測(cè)在理論研究和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都具有重要意義

　　在合適的外界條件下，一個(gè)微生物細(xì)胞不斷地吸收營(yíng)養(yǎng)，按照自己的代謝模式進(jìn)行代謝。如果同化的速度超過異化的速度，原生質(zhì)的總量(重量、體積、大小)就會(huì)不斷增加，于是就有了個(gè)體的成長(zhǎng)。如果這是一種平衡生長(zhǎng)，即當(dāng)每個(gè)細(xì)胞成分以適當(dāng)?shù)谋壤L(zhǎng)時(shí)，達(dá)到一定程度后就會(huì)繁殖，從而引起個(gè)體數(shù)量的增加。這時(shí)，原來的個(gè)體已經(jīng)發(fā)展成了群體。隨著一個(gè)群體中每個(gè)個(gè)體的進(jìn)一步成長(zhǎng)，引起這個(gè)群體的成長(zhǎng)，可以用它的體積、重量、密度或濃度來衡量。微生物的生長(zhǎng)不同于其他生物的生長(zhǎng)，微生物的個(gè)體生長(zhǎng)在科學(xué)研究上是困難的，通常沒有實(shí)際意義。微生物以數(shù)量取勝， 所以微生物的增長(zhǎng)通常是指種群的擴(kuò)大。微生物的生長(zhǎng)繁殖是其與各種內(nèi)外環(huán)境因素相互作用的綜合反映。因此，生長(zhǎng)和繁殖可以作為研究各種生理、生化和遺傳問題的重要指標(biāo)。同時(shí)，微生物在生產(chǎn)實(shí)踐中的各種應(yīng)用或病原性、霉變性微生物的防治都與其生長(zhǎng)抑制密切相關(guān)。因此有必要介紹微生物生長(zhǎng)的檢測(cè)方法。由于生長(zhǎng)意味著原生質(zhì)含量的增加，所以測(cè)定方法都是以直接或間接為基礎(chǔ)，而繁殖的測(cè)定則應(yīng)以計(jì)數(shù)為基礎(chǔ)。微生物的生長(zhǎng)可以通過其重量、體積、密度、濃度來衡量，作為衡量的指標(biāo)。

　　1.微生物測(cè)定法

　　1.1體積測(cè)量方法

　　又稱菌絲體濃度測(cè)量法，通過測(cè)量體積培養(yǎng)基中所含菌絲體的量來反映微生物的生長(zhǎng)狀況。方法是:將一定量的培養(yǎng)液(如10 mL)放入帶刻度的離心管中，設(shè)定離心時(shí)間(如5 min)和轉(zhuǎn)速(如5000 rpm)，離心后倒出上清液。當(dāng)測(cè)得上清液體積為V時(shí)，菌絲體濃度為(10-v)/10。菌絲體濃度的測(cè)定是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中微生物生長(zhǎng)的重要監(jiān)控指標(biāo)。這種方法廣泛、簡(jiǎn)單、快速，但需要設(shè)定一致的處理?xiàng)l件，否則偏差會(huì)很大，因?yàn)殡x心沉淀中混有一些固體營(yíng)養(yǎng)物，結(jié)果會(huì)有偏差。

　　干重法

　　它可以通過離心或過濾來確定。一般干重為濕重的10~20%。在離心法中，將待測(cè)體積的培養(yǎng)液倒入離心管中，以設(shè)定的離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速離心，用清水離心洗滌1-5次，并干燥。干燥可在105℃或100℃的烘箱中進(jìn)行，或通過紅外線，或通過80℃或40℃的真空干燥，然后稱重。如果用過濾法，絲狀真菌可以用濾紙過濾，細(xì)菌可以用醋酸纖維素膜等濾膜過濾。過濾后，用少量水洗滌，并在40℃真空干燥。叫干繁殖法很復(fù)雜。通常，當(dāng)獲得的微生物產(chǎn)物為菌體時(shí)，常采用這種方法，如活性干酵母、ADY)、一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。

　　1.3濁度法

　　微生物的生長(zhǎng)導(dǎo)致培養(yǎng)物濁度增加。紫外分光光度計(jì)用于測(cè)量該波長(zhǎng)處的光吸收值，以判斷微生物的生長(zhǎng)情況。一個(gè)帶側(cè)臂的新三角瓶可以用來定期跟蹤培養(yǎng)物中細(xì)菌的生長(zhǎng)。將側(cè)臂插入光電比色計(jì)比色座的孔中，無需取菌液即可隨時(shí)測(cè)定其生長(zhǎng)情況。這種方法主要用于監(jiān)控發(fā)酵工業(yè)中細(xì)菌的生長(zhǎng)。如UN公司的紫外-可見分光光度計(jì)，通過用比色管在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值OD600，來監(jiān)測(cè)大腸桿菌的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)時(shí)間。

　　1.4菌絲體長(zhǎng)度測(cè)量方法

　　對(duì)于絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養(yǎng)基中測(cè)量菌絲的生長(zhǎng)長(zhǎng)度，或者用一端開口、帶有刻度的細(xì)玻璃管，進(jìn)入合適的培養(yǎng)基，躺下，在開口的一端接種微生物，一段時(shí)間后記錄菌絲的生長(zhǎng)長(zhǎng)度，從而測(cè)量絲狀微生物的生長(zhǎng)情況。

　　2.微生物計(jì)數(shù)法

　　2.1血細(xì)胞計(jì)數(shù)平板法

　　血細(xì)胞計(jì)數(shù)板是一種具有結(jié)構(gòu)尺度和厚度的厚玻璃片。載玻片上有四個(gè)凹槽和兩個(gè)脊，中央有一個(gè)短的水平凹槽和兩個(gè)平臺(tái)。兩個(gè)脊的表面比兩個(gè)平臺(tái)的表面高0.1毫米。每個(gè)平臺(tái)上刻有不同規(guī)格的網(wǎng)格，中心0.1 mm2的面積上刻有400個(gè)小方塊。用油鏡觀察，統(tǒng)計(jì)一個(gè)大細(xì)胞中的微生物數(shù)量，就可以算出1毫升菌液中所含的細(xì)菌數(shù)量。這種方法簡(jiǎn)單、直觀、快速，但只適用于對(duì)單細(xì)胞微生物或絲狀微生物產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)。

　　2.2染色計(jì)數(shù)法

　　為了彌補(bǔ)某些微生物在油鏡下不易觀察計(jì)數(shù)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)平板法無法直接區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的不足，人們發(fā)明了染色計(jì)數(shù)法。借助不同的染料，在顯微鏡下可以更方便地計(jì)數(shù)活菌。例如，可以用亞甲藍(lán)染色液來計(jì)數(shù)酵母活細(xì)胞的數(shù)量。染色后，活細(xì)胞無色，死細(xì)胞藍(lán)色。

　　2.3比例計(jì)數(shù)法

　　將顆粒濃度已知的液體(如霉菌孢子或紅細(xì)胞)與待測(cè)細(xì)胞濃度的菌液按比例均勻混合，通過在顯微鏡視野內(nèi)計(jì)數(shù)它們各自的數(shù)量，即可得到未知菌液的細(xì)胞濃度。這種計(jì)數(shù)方法比較廣泛。并且有必要制備具有已知顆粒濃度的懸浮液作為標(biāo)準(zhǔn)。

　　2.4液體稀釋法

　　未知細(xì)菌樣本被連續(xù)稀釋10倍。根據(jù)估計(jì)的數(shù)量，從三個(gè)合適的連續(xù)10倍稀釋物中取出5 mL樣品，并接種到1 mL至三組15個(gè)含有培養(yǎng)液的試管中。培養(yǎng)后，記錄每個(gè)稀釋度下生長(zhǎng)的試管數(shù)，然后通過查MPN(最可能數(shù))得到細(xì)菌樣本中的細(xì)菌數(shù)，根據(jù)樣本的稀釋倍數(shù)計(jì)算活菌含量。這種方法常用于檢測(cè)食品中的微生物，如飲用水和牛奶的微生物限度檢查。

　　2.5平板菌落計(jì)數(shù)法

　　這是一種計(jì)數(shù)活細(xì)菌的常用方法。對(duì)待測(cè)菌液進(jìn)行梯度稀釋，取一定體積稀釋后的菌液，在固化前與合適的固體培養(yǎng)基混合均勻，或?qū)⒕和坎荚诠袒蟮墓腆w培養(yǎng)基平板上。孵育后，原始細(xì)菌溶液的細(xì)菌計(jì)數(shù)可以通過將平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以細(xì)菌溶液的稀釋度來計(jì)算。直徑9 cm的平板上一般要出現(xiàn)50~500個(gè)菌落。但是方法比較麻煩，操作者需要熟練的技術(shù)。平板菌落計(jì)數(shù)法不僅可以得到菌液中的活菌數(shù)，而且可以一次分離培養(yǎng)菌液中的細(xì)菌，得到單克隆。

　　2.6試劑紙

　　在平板計(jì)數(shù)法的基礎(chǔ)上，開發(fā)了用于快速計(jì)數(shù)的小型商用產(chǎn)品。有小而厚的濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂上吸取合適的培養(yǎng)基，加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，無色)浸泡試驗(yàn)菌液，然后在密封包裝袋中培養(yǎng)。短期培養(yǎng)后，可將濾紙上玫瑰色微菌落的密度與標(biāo)準(zhǔn)紙色板上的光譜進(jìn)行比較，以估計(jì)樣品的細(xì)菌含量。試紙計(jì)數(shù)法快速準(zhǔn)確，避免了平板計(jì)數(shù)法的人為操作誤差。

　　2.7薄膜過濾法

　　含菌樣品用專用濾膜過濾體積，橙黃染色，紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光。活細(xì)胞會(huì)發(fā)出橙色熒光，而死細(xì)胞會(huì)發(fā)出綠色熒光。

　　3.間接測(cè)定法

　　微生物的生長(zhǎng)伴隨著一系列生理指標(biāo)的變化，如pH值、含氮量、含糖量、產(chǎn)氣量等。與生長(zhǎng)量平行的生理指標(biāo)有很多，可以作為生長(zhǎng)測(cè)量的相對(duì)值。因此，生理指標(biāo)等間接參數(shù)可以用來衡量生物量。

　　3.1氮含量的測(cè)定

　　大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%。根據(jù)含氮量×6.25，可以確定粗蛋白的含量。測(cè)定氮含量的方法有很多，如碘消化法、磷酸消化法和杜馬斯法測(cè)定N2氣體。杜馬斯測(cè)量N2氣體的方法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱，產(chǎn)生氮?dú)猓占诤粑?jì)中，用KOH吸收CO2后測(cè)量N2的量。

　　3.2碳含量的測(cè)定

　　將少量(0.2~2.0 mg干重)生物材料混入1 mL水或無機(jī)緩沖液中，用2 mL 2% 2% K2Cr2O7溶液在100℃加熱30分鐘，然后冷卻。加水稀釋至5 mL，在580 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值，計(jì)算生長(zhǎng)量。需要使用試劑作為空白對(duì)照，使用標(biāo)準(zhǔn)樣品作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　還原糖測(cè)定方法

　　還原糖通常指單糖或寡糖，可被微生物直接利用。還原糖的測(cè)定可以間接反映微生物的生長(zhǎng)情況，常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中微生物生長(zhǎng)的常規(guī)監(jiān)測(cè)。方法是:離心，取上清液，加入費(fèi)林試劑，沸水浴煮沸3分鐘，取出加少許酸化，在接近終點(diǎn)時(shí)加入淀粉溶液，繼續(xù)加入Na2S2O3至終點(diǎn)，查表讀出還原糖含量。

　　3.4氨基氮的測(cè)定

　　離心，取上清液，加入甲基紅和指示劑，加入0.02 mol/L NaOH顯色至顏色剛好褪色，加入18%中性底物，反應(yīng)數(shù)分鐘，加入0.02 mol/L NaOH使其變色，根據(jù)NaOH用量計(jì)算氨基氮含量。根據(jù)培養(yǎng)基中氨基氮的含量，可以間接反映微生物的生長(zhǎng)狀況。

　　3.5其他生理物質(zhì)的測(cè)定

　　P、DNA、RNA、ATP、NAM(乙酰胞壁酸)的含量和其他指標(biāo)，如產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、產(chǎn)CO2(使用標(biāo)記作為底物)、耗氧量、粘度和產(chǎn)熱，可用于確定生長(zhǎng)。還可以根據(jù)反應(yīng)前后底物濃度、最終產(chǎn)氣量、微生物活性的變化來反映微生物的生長(zhǎng)情況。比如在BMP-2的發(fā)酵生產(chǎn)中，可以隨時(shí)監(jiān)測(cè)溶解氧和pH值的變化來判斷細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。

　　4.商業(yè)快速微生物檢測(cè)方法

　　微生物檢測(cè)的發(fā)展方向是快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便和自動(dòng)化。目前，許多生物制品公司利用傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)原理，結(jié)合不同的檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)出各種類型的微生物檢測(cè)儀器和設(shè)備，逐漸廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微生物檢測(cè)和科學(xué)研究中。例如:

　　4.1試劑盒、培養(yǎng)基和其他手段

　　抗干擾培養(yǎng)基與快速微生物數(shù)量檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合，解決了傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法無法解決的問題，為建立完整的抗干擾微生物檢測(cè)系統(tǒng)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。如:抗干擾微生物培養(yǎng)基、新型生化鑒定管、微生物計(jì)數(shù)卡、環(huán)境質(zhì)量檢測(cè)試劑盒等。，可方便地用于多種測(cè)試。

　　4.2借助新儀器

　　BACTOMETER的全自動(dòng)細(xì)菌總數(shù)和快速細(xì)菌檢測(cè)系統(tǒng)可在數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得監(jiān)測(cè)結(jié)果，樣本的顏色和光學(xué)特性不影響讀數(shù)。它對(duì)酵母和霉菌的檢測(cè)也非常敏感。原理是通過阻抗技術(shù)將待測(cè)樣品和培養(yǎng)基置于反應(yīng)試劑盒中，底部有一對(duì)不銹鋼電極，測(cè)量微生物生長(zhǎng)引起的阻抗變化。例如，當(dāng)微生物生長(zhǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中的大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以通過代謝轉(zhuǎn)化為活性小分子，這種微弱的變化可以用電阻抗法檢測(cè)，這樣就可以比傳統(tǒng)的平板法更快地監(jiān)測(cè)微生物的存在和數(shù)量。測(cè)定項(xiàng)目包括細(xì)菌總數(shù)、酵母菌、大腸桿菌、霉菌、乳酸菌、嗜熱菌、 革蘭氏陰性菌等。

　　微生物OD值是反映細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)的指標(biāo)，OD是光密度的縮寫，表示被檢測(cè)對(duì)象吸收的光密度。通常400~700 nm是微生物測(cè)定的范圍，所以需要用紫外分光光度計(jì)測(cè)量吸收波長(zhǎng)。最常用的有:菌絲體505 nm，酵母560 nm，細(xì)菌600 nm。通過測(cè)定OD值繪制微生物生長(zhǎng)曲線時(shí)，同一菌株的初始培養(yǎng)濃度可準(zhǔn)備多個(gè)試管(根據(jù)檢測(cè)點(diǎn)的需要，如需檢測(cè)10個(gè)點(diǎn)，可準(zhǔn)備10個(gè)試管)，然后從每個(gè)點(diǎn)取一個(gè)試管測(cè)OD值。

　　一般用于測(cè)量細(xì)胞密度的OD的波長(zhǎng)范圍為580 nm-660 nm，如枯草芽孢桿菌的600 nm，已經(jīng)屬于可見光區(qū)(200 nm-400 nm為紫外光區(qū)，400 nm-800 nm為可見光區(qū))。如果空白是水做的，需要離心清洗；如果空白是用未接種的培養(yǎng)基制作的，則不需要清洗，但未接種的培養(yǎng)基應(yīng)與接種同時(shí)培養(yǎng)，以達(dá)到相同的條件。之后注意OD值一般控制在0.1~0.4，這個(gè)區(qū)域的數(shù)值比較可靠。如果OD大于1.0，則應(yīng)稀釋并再次測(cè)量。因?yàn)镺D太大，分光光度計(jì)的靈敏度會(huì)明顯降低。

　　一般測(cè)量吸收值，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中保持細(xì)菌稀釋倍數(shù)一致就好，吸收值與稀釋倍數(shù)不成正比，可以保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的可比性。而且取值的時(shí)候要連續(xù)讀，重復(fù)三遍。

　　另外，為什么用分光光度計(jì)測(cè)量微生物的OD值時(shí)，波長(zhǎng)要設(shè)置為600 nm？

　　這個(gè)波長(zhǎng)其實(shí)只針對(duì)濁度，分光光度計(jì)在600 nm處對(duì)濁度比較敏感。測(cè)量吸收峰實(shí)際意義不大。例如，在LB搖瓶中過夜培養(yǎng)的大腸桿菌實(shí)際上在400納米以上有吸收，但那很可能是培養(yǎng)液的吸收峰。